MASSBIOME TEKNOLOJİSİ
Oxford Nanopore R10.4.1 kimyası ve uzun okuma teknolojisi Massive Bioinformatics tarafından geliştirilen MASSBIOME yazılımı ile güçlendirilmektedir.
DNA İzolasyonu ve Hazırlık
Mikrobiyom analizlerinde en kritik hata kaynağı, numune alındığı andan laboratuvara ulaşana kadar geçen sürede bakteriyel popülasyonun değişmesidir (Blooming Effect). MassBiome, bu riski ortadan kaldırmak için validasyonu yapılmış özel bir kimyasal stabilizasyon yöntemi kullanır.
MassBiome süreci, fekal numunelerden yüksek saflıkta mikrobiyal DNA elde edilmesiyle başlar. Kullanılan metodoloji, PCR inhibitörlerini (örn. Hümik asit) verimli bir şekilde uzaklaştırarak sekanslama başarısını garanti altına alır.
Islak Laboratuvar Protokolü
- Mekanik Liziz: BashingBead Lysis Tubes kullanılarak gram-pozitif bakterilerin ve zorlu hücre duvarlarının etkin parçalanması.
- İzolasyon Kiti: Quick-DNA Fecal/Soil Microbe DNA Miniprep Kit (Zymo Research) ile yüksek verimli DNA eldesi.
- PCR Amplifikasyonu: Mobiomx 2x HiFi Taq Master Mix kullanılarak hatasız çoğaltma.
16S V1-V9 Tam Uzunluk (Full Length)
Geleneksel yöntemler (Illumina vb.) 16S geninin sadece V3-V4 gibi kısa bölgelerini (400-500bp) hedeflerken, MassBiome teknolojisi genin tamamını (~1466bp) tek parça halinde okur. Bu, "Cins" (Genus) seviyesinde kalmayıp "Tür" (Species) seviyesinde kesin ayrım yapabilmemizi sağlar.
| ÖZELLİK | Geleneksel Yöntemler (V3-V4) | MassBiome (V1-V9 Full Length) |
|---|---|---|
| Okuma Uzunluğu | ~460 Baz Çifti (bp) | ~1500 Baz Çifti (bp) |
| Tanımlama Seviyesi | Genellikle Cins (Genus) | Tür (Species) |
| Primer Seti | Standart V3-V4 | LR-Primer-16S V1-V9 |
| Filogenetik Çözünürlük | Düşük | Yüksek (Tüm değişken bölgeler dahildir) |
Oxford Nanopore R10.4.1 KİMYASI
Amplikonlar, barkodlanarak (Barcoding) tek bir havuzda toplanır ve Oxford Nanopore'un en yeni nesil akış hücrelerinde (R10.4.1 Flow Cell) işlenir. Bu teknoloji, DNA molekülünün nanoporlardan geçerken yarattığı elektriksel akım değişimini doğrudan okuyarak baz dizilimini belirler.
Q20+ Kimyası
En son R10.4.1 por versiyonu ve V14 kit kimyası (SQK-NBD114.96) sayesinde %99'un üzerinde ham okuma doğruluğu (Raw Read Accuracy) sağlanır.
Gerçek Zamanlı Veri
MinION cihazı, sekanslama devam ederken veri üretir (Real-time Basecalling), bu da analiz süresini günler değil saatler mertebesine indirir.
MASSBIOME BİYOİNFORMATİK İŞ AKIŞI
Ham FastQ verileri, Snakemake tabanlı özel bir biyoinformatik boru hattında (Pipeline) işlenir. Bu süreç tamamen otomatizedir ve insan hatasını minimize eder.
Bu süreçte:
- Uzunluk ve kalite filtreleri uygulanır,
- Düşük kaliteli ve hedef dışı okumalar elenir,
- Massive Bioinformatics tarafından oluşturulan geniş 16S referans veritabanı kullanılarak tür düzeyinde taksonomi ataması yapılır,
- Farklı türlerdeki 16S kopya sayıları dikkate alınarak bolluk değerleri normalize edilir,
- Alfa çeşitlilik, Firmicutes/Bacteroidetes oranı, fonksiyonel gruplar, probiyotik ve vitaminle ilişkili bakteriler, patojenler ve biyobelirteç bakteriler hesaplanır,
- On binlerce hasta/sağlıklı örneğe dayalı makine öğrenmesi modelleriyle, 22’den fazla hastalık için mikrobiyom benzerlik/uzaklık profilleri çıkarılır.
KALİTE KONTROL
QC & FİLTRELEME
Q-Score > 15 & Uzunluk Filtresi > 1000
TÜR DÜZEYİNDE
taxonomy
MassBiome Referans Setine Hizalaması
PROFİLLER
HESAPLAMALAR
Fonksiyonel Gruplar, Probiyotik vb.
ÜRÜN
RAPORLAMA
Mikrobiyota Analiz Raporu
Raporlama ve Makİne Öğrenmesİ
MassBiome raporlarının gücü, hastanın verisini izole olarak değil, 10.000+ sağlıklı bireyden oluşan "Referans Kohort" ile karşılaştırmalı olarak analiz etmesinden gelir.
Elde edilen taksonomik profil, MassBiome'un 10.000+ sağlıklı bireyden oluşan veri tabanıyla kıyaslanır. Rapor çıktısı sadece bakteri isimlerini değil, bunların klinik anlamlarını da içerir.
- Mikrobiyom çeşitliliği ve F/B oranı,
- Enterotip (mikrobiyom tipi),
- Fonksiyonel bakteri grupları ve vitamin ilişkili bakteriler,
- Patojenler ve biyobelirteç bakteriler,
- Hastalıklara yatkınlık/korunma desenleri,
- Ruh haliyle ilişkili risk profili,
- Kişiselleştirilmiş beslenme, probiyotik ve takviye önerileri
gibi başlıkları içerir. Böylece MassBiome, laboratuvar verisini sadece teknik bir çıktı olmaktan çıkarıp, hekim ve son kullanıcı için somut, aksiyon alınabilir bir klinik karar destek aracına dönüştürür.
sıkça sorulan sorular
Neden Illumina V3-V4 yerine Oxford Nanopore V1-V9 kullanıyorsunuz?
16S ribozomal bölgesi prokaryotik ribozomun 30S alt birimidir. Bu gen bölgesi hedefli metagenomik dizilemelerde arke ve bakteriler için en sık kullanılan bölgelerden biridir. 16S rRNA genleri genellikle, farklı türler arasında önemli sekans farklılıkları gösteren ve tür tanımlaması için kullanılabilen dokuz "hiperdeğişken bölge" içerir. Ribozomal RNA dizilerinin farklılıklarına dayanarak, mikrobiyomun yapısı ve türlerin relative abundance'ı açığa çıkarılabilir.
Standart V3-V4 analizi 16S geninin sadece ~450 bazlık kısa bir bölgesini okur ve genellikle sadece "Cins" (Genus) seviyesinde tanımlama yapar. MassBiome ise ~1500 bazlık genin tamamını (Full-Length) okuyarak "Tür" (Species) seviyesinde, hatta bazı durumlarda alt-tür seviyesinde kesin ayrım sağlar. Örneğin, E. coli ile zararsız akrabalarını birbirinden ancak bu teknolojiyle ayırabilirsiniz.
MassBiome hangi Oxford Nanopore cihazlarıyla uyumlu?
MassBiome, MinION (Mk1B/Mk1C/Mk1D), GridION ve PromethION cihazlarından alınan .pod5 ve .fastq verileriyle tam uyumludur.
Nanopore teknolojisinin hata oranı (Error Rate) yüksek değil mi?
Eski Nanopore versiyonlarında bu doğruydu ancak kullandığımız yeni R10.4.1 akış hücreleri ve Q20+ V14 Kimyası ile ham okuma doğruluğu %99'un üzerine çıkmıştır (Q20 skoru). Ayrıca biyoinformatik pipeline'ımızdaki yapay zeka destekli düzeltme algoritmalarıyla bu oran klinik standartlara ulaşır.
Sonuçlanma süresi (Turnaround Time) nedir?
Numune laboratuvara ulaştıktan sonra; DNA izolasyonu, kütüphane hazırlığı ve sekanslama süreci toplamda 24-48 saat sürer. Biyoinformatik analiz ve raporlama ise otomatize sistemimiz sayesinde verinin yüklenmesinden itibaren ortalama 2-4 saat içinde tamamlanır. Toplamda 3 iş günü içinde sonuç verebilirsiniz.
Yerel sunucu (On-Premise) kurulumu mümkün mü?
Evet. MassBiome tam olarak bu vizyonla, veri egemenliği gerektiren kurumlar için kendi verilerinizi kendi bünyenizde değere dönüştürebilmenizi sağlamak amacıyla dizayn edildi. Bu nedenle sistem tamamen in-house olarak tasarlandı. Siz laboratuvarınıza MassBiome kurmak istediğinizde Massive Bioinformatics tarafından sağlanan yüksek performanslı bir MassBiome bilgisayarı ile birlikte bu ihtiyacınızı karşılıyor olacaksınız.
Sistemi kurmadan önce demonstrasyon talebinde bulunabilir miyim?
Elbette. Massive Bioinformatics olarak, yüksek yatırım maliyetlerinin kurumları ne kadar yıprattığının farkındayız. Bu nedenle yatırımınızın geri dönüşü konusunda kendimize güveniyor ve kurumunuz için en uygun demonstrasyon tipleri ile kurumunuza destek olabiliyoruz.
Numune güvenliğini nasıl sağlıyorsunuz?
Numunelerin yerel lojistik süreçlerinde güvenliğini sağlamak için koruyucu sıvı şarttır. Numune korumasını sağlamak amacıyla kapsamlı çalışmalar yürüttük ve ekte "Koruyucu Solüsyon Stabilite Analizi"ne ilişkin detaylı bir rapor bulunmaktadır.
Numuneler gerçekten oda sıcaklığında bozulmadan ne kadar dayanır? Soğuk zincir (buz aküsü) şart mı?
MassBiome stabilizasyon sıvısı, DNA/RNA bütünlüğünü oda sıcaklığında (+20°C ila +25°C) 4 haftaya kadar koruyacak şekilde formüle edilmiştir. Buz aküsü veya kuru buz kullanımı zorunlu değildir; bu sayede lojistik maliyetleriniz düşer. Validasyon çalışmalarımızda, 28. günde dahi "0. Gün" (taze numune) ile %99 taksonomik benzerlik elde edilmiştir.
Tek bir Flow Cell (Akış Hücresi) ile kaç numune çalışabilirim?
R10.4.1 Flow Cell kapasitesi ve barkodlama kitlerimizle, tek seferde 12 ila 96 numuneyi aynı anda (multiplexing) çalışabilirsiniz. Önerilen optimum sayı yatırım maliyeti/maliyet/performans açısından değerlendirildiğinde genellikle 24 veya 48'dir. Numune sayısı arttıkça, örnek başına maliyetiniz düşer.
Kit içeriğinde DNA izolasyonu için gerekli tüm sarflar var mı?
Evet. MassBiome Paketi; Zymo Research dışkı DNA izolasyon kitleri, Mobiomx V1-V9 primerleri, PCR master mix, ligasyon enzimleri ve barkodlama kitleri dahil olmak üzere "Sample-to-Result" (Numuneden Sonuca) mantığıyla gerekli tüm biyokimyasalları içerir. Ekstra sadece genel laboratuvar sarflarına (pipet ucu, etanol vb.) ihtiyacınız olur.